鈣離子成像

光遺傳學應用以及成果不僅得益于其核心技 術 ( 微生物視蛋白變體、視蛋白靶向策略、光靶向裝置 ) 的發展，也得益于與輔助技術的整合，涉及電生理學、神經元活動成像等數據讀取，這樣的整合方式賦予了光遺傳學在不同時間尺度、不同空間尺度上發揮功能的優勢。

近年來，鈣離子成像與熒光顯微技術作為新興的腦活動呈現技術得到了快速發展。神經元鈣離子成像是目前腦功能研究中觀察神經元以及神經環路活動監測的Z常用手段之一。其原理是神經元激活伴隨著鈣離子進入細胞，與鈣離子指示劑結合會出現熒光強度的改變，從而體現神經活動變化，對神經活動可進行長達數月的監測，實現長期體內神經元成像。鈣離子指示劑是目前Z常用的基因編輯熒光指示劑，來自于綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 或其變異體、鈣調蛋白 (calmodulin， CaM)、肌球蛋白輕鏈激酶 M13 域的融合，其中鈣指示劑 GCaMP6 由于*的敏感度，廣泛應用于在體成像研究中。光遺傳集成顯微系統，整合了光遺傳學與鈣成像技術，利用單光子成像技術，使用 LED作為光源，將梯度折射率透鏡 (gradient refractive index，GRIN) 作為物鏡。這種集成顯微鏡可以在自由活動的老鼠中實現高速大規模縱向記錄特定神經元群體的鈣離子動態，從而反映神經元與神經環路的活動情況。

新一代光遺傳學技術達到了目前研究所需要的高時間、空間、細胞類型分辨率，具備單個神經元與神經纖維分辨率的神經元群體的長期監測能力 ( 表 1) 。

自由活動神經元超微鈣離子成像系統 nVista 和 結合光遺傳自由活動神經元超微鈣離子成像系統nVoke 是目前Z先進的光遺傳集成顯微系統，在神經環路疾病的研究上具有很大的優勢。上述集成系統能夠整合光遺傳學調控和實時鈣離子成像，通過微型植入式探頭，在自由活動的動物上長期觀察特定神經元群體與腦環路的神經活動，可以實現自動聚焦、精準定位任意目標區域、無需手工調整，最終將同時段的行為學記錄、電生理信息、鈣離子成像等進行多模態整合，對于參與特定腦疾病神經環路中的細胞進行解析，繪制環路細胞類型與功能圖譜，解釋特定腦疾病的潛在發病機制。

功能和用途

1、功能：本儀器是基于多模光纖的微弱熒光信號檢測和記錄系統，能夠穩長時間穩定的激發綠色熒光，并檢測熒光信號的微弱變換。

2、用途：用于在體記錄動物群體神經元活動鈣信號的動態變化，主要用途和特點如下：　

通過光學記錄通過遺傳手段所確定的特定細胞類型在自然狀態下的神經活動；

實時觀測動物在進行復雜行為時的神經投射活動；

闡明特殊的神經環路在動物行為中的作用；

檢測新型可遺傳編碼的乙酰膽堿和多巴胺等探針的熒光變化，即可實時監測乙酰膽堿、多巴胺等濃度的動態變化情況；

通過直接觀測和投射相關的活動從而在根本上了解以前不可能接觸到的神經環路的動態行為；

 

 

• 光遺傳學技術的應用

光遺傳學技術可以實現在神經元的快速精準控制以及數據讀取，極大程度上促進了神經科學發展， 幫助業內學者了解更復雜的神經過程(如學習、睡眠、視覺、成癮、運動，等 )，對于腦疾病中神經環路的解析具有重要意義，并且有望用于尋找各種神經疾病治療的新靶點。

腦疾病神經環路研究 神經環路是由一系列相聯系的神經元構成的具有明確功能的神經元之間的纖維聯系，是大腦神經系統的基本單元。對于腦疾病的理解可以來自于多個層面，從細胞分子水平的微觀水平到動物行為的宏觀水平，前期的研究主要集中在微觀細胞分子水平與宏觀動物行為水平。以神經環路為基礎的腦功能連接組圖譜，對于理解腦功能意義重大，要提高對神經系統疾病的認識，目前急需的是識別潛在的神經環路的異常。腦疾病如阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓病 (Huntington’s disease，HD)、癲 等所發生的病理生理變化會影響 正常神經環路的功能，產生相應的臨床癥狀，了解其神經環路的異常變化是理解疾病發生發展機制以及尋找相應治療方案的必經途徑 。

• AD

AD是老年人中最常見的慢性神經退行性疾病，進行性記憶衰退是疾病特征，患者隨后認 知損害更廣泛，顯著受影響的是學習與記憶神經環路。目前，海馬區域的神經環路以及其與前額葉皮質區相互聯系是被廣泛研究的腦區域。海馬結構與前額葉皮質以雙向方式相互作用，調節多種認知功能以及處理情緒信息，是大腦記憶系統中極為重要的結構，有助于新信息的快速編碼、記憶網絡的整合、檢索與組織。

發作性記憶進行性喪失是 AD 早期的常見癥狀，大腦中記憶儲存在一群特定神經元 —— 海馬印跡細胞中。AD 早期的記憶衰退的機制并不明確，可能是信息編碼與整合或是存儲與檢索神經環路受損。利用新一代光遺傳學技術，研究人員發現印跡細胞傾向于通過重復性活動以同步、協調的方式進行工作，不同群體的印跡細胞組成不同類型的同步性活動呈現記憶( 圖 3)。通過對 AD 早期轉基因小鼠海馬區印跡與非印跡細胞進行長時間的區分、監測和調控，發現激活海馬印跡細胞可以促使記憶恢復，說明 AD記憶損傷是由于記憶檢索提取相關神經環路受損所致，而不是記憶存儲的損傷所致。

利用 AD 小鼠模型，研究人員發現在 AD 典型病理變化 β 淀粉樣斑塊沉積產生之前，小鼠的遺忘呈現出年齡依賴性，與海馬齒狀回的棘突密度有關。利用新一代光遺傳學技術長期刺激齒狀回神經元，通過誘導齒狀回印跡細胞產生長時程增強，促進棘突密度以及長期記憶的恢復，并且去除這部分印跡細胞可以阻止長期記憶的恢復，提示 AD 早期選擇性的挽救恢復印跡細胞的棘突密度可能是治療記憶喪失的有效靶點。

• PD

PD 是一種神經退行性疾病，中腦黑質致密部和腹側被蓋區的多巴胺能神經元逐漸死亡是 其病理特征。PD 的主要癥狀是運動障礙，包括靜止性震顫、肌肉僵硬和運動無力。典型發病機制是紋狀體功能失調，直接與間接通路功能失衡所致 ( 圖4)。涉及的主要神經元為中間棘狀神經元 (medium spiny neuron，MSN)，主要表達多巴胺 D1 和 D2 兩種受體。光遺傳學研究提供了紋狀體 MSN、中間神經元和傳入神經元的詳細信息，從而對于 PD 的基 本病理做出了解析。光遺傳學在 PD 的運動功能、多巴胺能神經元移植、病理環路研究上得到較多應用，特別是 PD 環路功能失調，是目前的研究熱門領域，近年獲得了眾多進展 ( 表 2)。

• 癲 癲

是一種由于神經元高興奮性引起的神經環路興奮性異常增高，從而出現癲 發作為特征的疾病。以往用于解析癲 神經環路異常的方法包括藥物刺激和光刺激釋放，這些方法受限于時間分辨率低以及谷氨酸補給。研究人員利用光遺傳技術的高時間與空間分辨率對以往存在質疑的失神發作環路進行了研究，發現丘腦皮質神經元的節律同步性腦電波發放以及階段性發放，對誘發失神發作中的同步尖峰放電波以及行為是必需且充分的。癲 發作嚴重影響患者生存質量，造成患者認知損害和記憶損傷，前期研究認為可能與海馬長期暴露于異常高鈣離子濃度下造成的損傷有關。常規技術無法在哺乳類動物海馬神經元觀察其鈣動力學，利用新一代光遺傳學技術，研究人員發現不僅在癲發作期間，而且在癲 發作出現以及 EEG 異常之前，海馬神經元的鈣動力學就出現了明顯異常，這種異常發現可以促使研究者抓住癲 發作前的時機從而控制癲 發作。海馬神經元內的鈣離子水平顯著高于正常水平，提示鈣興奮性細胞毒性可能是癲 致認知損害的原因。有趣的是常規抗癲 藥物丙戊酸鈉并未改變在癲 中所觀察到的鈣離子動力學的異常。未來可以利用大規模的神經元鈣離子成像平臺進行新的抗癲藥物篩選，為癲 治療提供新視角。

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